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蛋白質(zhì)提取與純化技術(shù)

2008-12-19 [1455]

選擇材料及預(yù)處理

  以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ),從分子水平上認(rèn)識生命現(xiàn)象,已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向,研究蛋白質(zhì),首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識,但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別,把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中,如鹽析,有機(jī)溶劑提取,層析和結(jié)晶等;二是將混合物置于單一物相中,通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達(dá)到分離目的,如電泳,超速離心,超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性,防止酸、鹼、高溫,劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個(gè)階段:選擇材料和預(yù)處理,細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離,提取和純化,濃細(xì)、干燥和保存。

  微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料,所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。對于微生物,應(yīng)注意它的生長期,在微生物的對數(shù)生長期,酶和核酸的含量較高,可以獲得高產(chǎn)量,以微生物為材料時(shí)有兩種情況:(1)得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等;(2)利用菌體含有的生化物質(zhì),如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。植物材料必須經(jīng)過去殼,脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同,其中所含生物大分子的量變化很大,另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對動物組織,必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料,先進(jìn)行絞碎、脫脂等處理。另外,對預(yù)處理好的材料,若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn),應(yīng)冷凍保存,對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。

 

蛋白質(zhì)的分離純化

一,蛋白質(zhì)(包括酶)的提取

  大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

(一)水溶液提取法

  稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)zui常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時(shí)需要均勻的攪拌,以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面,多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利于溶解,縮短提取時(shí)間。但另一方面,溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活,因此,基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫(5度以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑(如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等)。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1pH
  蛋白質(zhì),酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì),提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí),應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化,一般來說,堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。
2、鹽濃度
  稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶,稱為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合,具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn),因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

(二)有機(jī)溶劑提取法

  一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶,不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別*,一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng),特別是溶解磷脂的能力強(qiáng);二是丁醇兼具親水性,在溶解度范圍內(nèi)(度為10%40度為6.6%)不會引起酶的變性失活。另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,也適用于動植物及微生物材料。

二、蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化方法很多,主要有:

(一)根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析
  中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱鹽溶;當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí),蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現(xiàn)象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4NH4)有很強(qiáng)的水化力,可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,使之失水,于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。
  影響鹽析的因素有:1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時(shí)溶解度低,更容易鹽析。2pH:大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度zui低。3)蛋白質(zhì)濃度:蛋白質(zhì)濃度高時(shí),欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(共沉現(xiàn)象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。
  蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應(yīng)用zui多的硫酸銨,它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大(25度時(shí)飽和溶液為4.1M,即767/升;0度時(shí)飽和溶解度為3.9M,即676/升),在這一溶解度范圍內(nèi),許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí),需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。
  蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)(常用的是玻璃紙),用緩沖液進(jìn)行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時(shí)間較長,所以在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25G-50過柱的辦法除鹽,所用的時(shí)間就比較短。

2、等電點(diǎn)沉淀法
  蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力zui小,因而溶解度也zui小,各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別,可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀,但此法很少單獨(dú)使用,可與鹽析法結(jié)合用。

3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法
  用與水可混溶的有機(jī)溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質(zhì)較易變性,應(yīng)在低溫下進(jìn)行。

(二)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾
  透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。
  超濾法是利用高壓力或離心力,強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

2、凝膠過濾法
  也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物zui有效的方法之一。柱中zui常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。

三)根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同,可將其分開。

1、電泳法
  各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下,因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度,當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時(shí),到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

2、離子交換層析法
  離子交換劑有陽離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素),當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí),帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。(詳見層析技術(shù)章)

(四)根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法

  親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。其基本原理:蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在,每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)的分離(Separation),提純(Purification
和鑒定(Characterization)是生物化學(xué)中的重要的一部分,至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來,因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

細(xì)胞的破碎

1、高速組織搗碎:將材料配成稀糊狀液,放置于筒內(nèi)約1/3體積,蓋緊筒蓋,將調(diào)速器先撥至zui慢處,開動開關(guān)后,逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿:先將剪碎的組織置于管中,再套入研桿來回研磨,上下移動,即可將細(xì)胞研碎,此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高,適用于量少和動物臟器組織。

3、超聲波處理法:用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液,使細(xì)胞急劇震蕩破裂,此法多適用于微生物材料,用大腸桿菌制備各種酶,常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,在1KG10KG頻率下處理10-15分鐘,此法的缺點(diǎn)是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱,應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。

4、反復(fù)凍融法:將細(xì)胞在-20度以下冰凍,室溫融解,反復(fù)幾次,由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。

5、化學(xué)處理法:有些動物細(xì)胞,例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉(SDS)、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞,細(xì)菌細(xì)胞壁較厚,可采用溶菌酶處理效果更好。

  無論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞,都會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中,使大分子生物降解,導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少,加入二異丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或減慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,還可通過選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等,使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。

濃縮、干燥及保存

一、樣品的濃縮

  生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀,為了保存和鑒定的目的,往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的:
1
、減壓加溫蒸發(fā)濃縮
  通過降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低,減壓的真空度愈高,液體沸點(diǎn)降得愈低,蒸發(fā)愈快,此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2
、空氣流動蒸發(fā)濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液,表面不斷通過空氣流;或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室,用電扇對準(zhǔn)吹風(fēng),使透過膜外的溶劑不沁蒸發(fā),而達(dá)到濃縮目的,此法濃縮速度慢,不適于大量溶液的濃縮。
3
、冰凍法 生物大分子在低溫結(jié)成冰,鹽類及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中,操作時(shí)先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體,然后緩慢地融解,利用溶劑與溶質(zhì)融點(diǎn)介點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時(shí),不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面,蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中,移去上層冰塊,可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。
4
、吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng),對生物大分子不吸附,易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等,使用聚乙二醇吸收劑時(shí),先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里,外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下,袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的體積。
5
、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的方法,不液體在一定壓力下(氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡海┩ㄟ^膜時(shí),溶劑和小分子透過,大分子受阻保留,這是近年來發(fā)展起來的新方法,zui適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽,并具有成本低,操作方便,條件溫和,能較好地保持生物大分子的活性,回收率高等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇,不同類型和規(guī)格的膜,水的流速,分子量截止值(即大體上能被膜保留分子zui小分子量值)等參數(shù)均不同,必須根據(jù)工作需要來選用。另外,超濾裝置形式,溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值:

膜名稱

分子量截留值

孔的大的平均直徑

XM300

300,000

140

XM200

100,000

55

XM50

50,000

30

PM30

30,000

22

UM20

20000

18

PM10

10,000

15

UM2

1,000

12

UM05

500

10

  用上面的超濾膜制成空心的纖維管,將很多根這樣的管攏成一束,管的兩端與低離子強(qiáng)度的緩沖液相連,使緩沖液不斷地在管中流動。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中。當(dāng)緩沖液流過纖維管時(shí),則小分子很易透過膜而擴(kuò)散,大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法,由于透析面積增大,因而使透析時(shí)間縮短10倍。

二、干燥

  生物大分子制備得到產(chǎn)品,為防止變質(zhì),易于保存,常需要干燥處理,zui常用的方法是冷凍干燥和真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫,易于氧化物質(zhì)的干燥和保存,整個(gè)裝置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外,同時(shí)增加了溫度因素。在相同壓力下,水蒸汽壓隨溫度下降而下降,故在低溫低壓下,冰很易升華為氣體。操作時(shí)一般先將待干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體,然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn),適用于各類生物大分子的干燥保存。

三、貯存

  生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定,在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無明顯變化,貯藏要求簡單,只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)(內(nèi)裝有干燥劑)密封,保持04度冰箱即可,液態(tài)貯藏時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。
1
、樣品不能太稀,必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏,樣品太稀易使生物大分子變性。
2
、一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑,常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。此外,鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護(hù)作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。
3
、貯藏溫度要求低,大多數(shù)在0度左右冰箱保存,有的則要求更低,應(yīng)視不同物質(zhì)而定。

 

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